明膠酶譜分析試劑盒凝膠無法聚合是怎么回事！

我公司基質金屬蛋白酶（MMP）明膠酶譜法（gelatin-zymography）電泳分析試劑是一種旨在通過明膠聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，在分離、蛋白復性、底物水解、染色等一系列步驟下，觀察并半定量深藍色背景中的無色清晰的基質金屬蛋白酶條帶，根據分子量確定特異基質金屬蛋白酶及其活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞萃取樣品（動物、人體、植物、昆蟲等）、培養(yǎng)上清懸液、血清和關節(jié)滑液或腦脊液等基質金屬蛋白酶-2，9，等活性及其抑制劑的檢測。產品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，敏感度高，條帶清晰，重復性好。

信帆生物生物科技有限公司一直貫徹客戶的原則為消費者提供高品質高性價比的科研產品。我們的產品貨期快、質量品牌有保障，售后技術服務完善，是很多科研單位和高校的供貨商。

產品檢測步驟：

1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染Marker 即可。
陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。
注：因為全血成分復雜,MMP活性較低，hao的方法是將全血中白細胞進行分離做陽性對照

3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。

4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低，應延長孵育時間為10小時或過夜。

6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72(MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現透明條帶。

7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示，并盡量設置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中常見的格式。

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參考文獻：

1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide
gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980,
102,196–202