谷氨酸合成酶(GOGAT)檢測(cè)試劑盒測(cè)定意義

產(chǎn)品說(shuō)明：
GOGAT 主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非綠色組織的前質(zhì)體中，和谷氨酰胺合成酶（GS）共同構(gòu)成 GS/GOGAT 循環(huán)，參與氨同化的調(diào)控。GOGAT 以 NADH 為電子供體，催化谷氨酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸形成兩分子的谷氨酸，NADH 在 340nm 吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。

測(cè)定意義：GOGAT分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同構(gòu)成GS/GOGAT循環(huán)，參與氨同化的調(diào)控。
測(cè)定原理：GOGAT催化谷氨酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸，形成兩分子的谷氨酸；同時(shí)NADH氧化生成NAD+，340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。
 

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
 

操作步驟：
一、粗酶液提取：細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
 

二、測(cè)定步驟：
1、紫外分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、工作液提前配置，平衡至室溫。

注意事項(xiàng)：
1、測(cè)定期間樣本在冰上放置，以免變性和失活。
2、盡量兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
3、當(dāng) A1 大于 1.5 或者?A 大于 0.6 時(shí)，建議將樣品用蒸餾水稀釋后測(cè)定，當(dāng)?A 過(guò)小時(shí)，可以延長(zhǎng)酶促反應(yīng)時(shí)間（10min 或 15min）或者加大加入的樣品體積進(jìn)行測(cè)量。
4、由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約 1mg/mL），所以在測(cè)定樣品蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量

谷氨酸合成酶(GOGAT)檢測(cè)試劑盒測(cè)定意義