正確認識糞大腸菌群

1.糞大腸菌群
糞大腸菌群作為地表水環境質量標準唯-一的一項微生物監測指標，我國多用多 管發酵法進行檢測，近幾年也更新了好幾個相關環境標準。

糞大腸菌群是總大腸菌群中的一部分，用來表明水質受污染的程度，主要來自糞便。糞大腸菌群是一類能使乳糖發酵、產酸產氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在44.5 ℃培養24~48ｈ能發酵乳糖產酸產氣。
通過對糞大腸菌群的監測，可了解水體受生活污水污染的狀況。糞大腸菌群適 用于河流、湖泊等地表水、企業污水及醫院廢水的監測，是綜合評價城 鎮污水，尤其是生活污水污染的一個*的重要指標。


２ 樣品的采集和保存
2.1 樣品采集
采樣人員大多缺乏細菌學監測知識，出現很多采樣不規范的現象。如：微生物項目水樣和理化水樣混采；滅菌瓶開蓋時間過早、水樣在空氣中暴露 時 間 過 長；水樣采集量過滿（既容易導致水樣中細菌缺氧死亡，又不利于水樣檢測前振蕩搖勻）；微生物樣品和其他理化項目同時采樣時，沒有做到細菌樣品優先采集；采樣人員在采集樣品時，沒注意避免采樣瓶受雜菌污染（手接觸到瓶蓋和瓶頸、采樣設備不規范）。
2.2 采樣瓶的準備和存放
采集糞大腸菌群的采樣瓶需要用牛皮紙封包好后，再經過高壓滅菌器滅菌才能使用。滅菌后的采樣瓶里如果含有少量冷凝水，可以放在烘箱里烘干。有條件的單位，也可以使用無菌采樣瓶。滅菌后的采樣瓶也有其保存期，超過兩周內未使用就必須重新滅菌。絕大部分實驗室都是在*滅菌后不再管其使用期 限。采樣瓶存放過久可能受到雜菌污染。
2.3 樣品運輸保存
在樣品的運輸和保存過程中，樣品的冷藏是關鍵（溫度過高過低都不利于樣品的保存）。由于儀器設備條件不夠，運輸過程不滿足樣品所需溫度或者路途遙遠，送檢時間超過６ｈ，都會導致樣品失效。樣品交接時間過長（在樣品送入實驗室之后，采樣人員要將采樣記錄移交給業務室，然后由接樣員對水樣進行編號并將檢測任務下發到監測室），導致樣品沒有及時分析而超過時限。特別是，在執法監測和污染源監督性監測中，需要的采樣時間長，有時還需 要 分 時 間 段 監 測，這過程很容易造成樣品超時。并且，樣品保存時間越長越不能保證樣品在合格的冷藏溫度下。這幾年，經常出現企業和監測機構因該項目實驗的特殊性發生糾紛。建議在采集細菌樣時，車上安裝車載冰箱、冷藏箱或者其他冷藏設備，可以實時監測溫度。加入冰塊保存時，樣品不可以直接接觸冰塊。不能保證樣品在有效期內送達實驗室分析時，可以考慮使用剛剛出臺的酶底物法（HJ1001-2018）進行現場檢驗。
３ 實驗室分析
3.1 試劑質量
3.1.1 培養基
培養基的質量是整個實驗檢測結果的保障，是實驗室質量控制的重要環節。分 析人員可能認為只要培養基在保質期內，都是合格的，而忽略了對培養基進行質量控制。

培養基需在濕度低、溫度不超過３０ ℃的房間避光保存，避免雜菌侵入。配置前，應該觀察培養基顏色和體積，變化明顯時廢棄不用。配好的培養基需要在２ｈ內進行高壓滅菌；對于不能及時滅菌的培養基，可以在冰箱內存放且不超過一天，因為滅菌不及時，就會影響其殺菌效果和營養成份的含量。培養基滅 菌結束后應迅速冷卻，避免長時間保存在滅菌鍋內，容易造成滅菌過度從而影響培養基的營養成分。配置的培養基不宜存放過久，堅持多配少量的原則，盡 量在一周內用完為好。每批培養基在使用前，都應對培養基進行質量鑒定，只有經過驗證合格的培養基，才能投入使用。

3.1.2無菌水
目前很多實驗室采用先配置所需量的稀釋水到試管中再統一滅菌。在實驗分析時發現由于稀釋水在高壓滅菌和冰箱存放這一系列過程中揮發，導致稀釋水在做樣時達不到所需的量。建議先用大容量玻璃瓶統一準備足量的無菌水和100ｍL的量筒，使用時在無菌環境下按所需量進行分裝。無菌水的配制盡量在當天或實驗前一天配置，-好實驗當天進行配制。無菌水需要調pH值、可在常溫保存。

3.2 操作方法
3.2.1 稀釋倍數  
有時候，企業污水、醫療廢水等糞大腸菌群污染嚴重的水樣需要稀釋到10-4～10-5ｇ／mL之后接種，但分析人員不能準確判斷其大致稀釋倍數，容易出現超出或者低于定量范圍。現行的環境監測分析方法與有關技術規范中糞大腸菌群檢數表里所列的幾個不定值（“＜”或“＞”）給監測工作帶來一定的困難。能否選擇出正確的稀釋度是實驗成敗的關鍵。

接種的稀釋比，為了避免在實 測 數 據 中 出 現 不 定值，實驗分析人員應充分了解自己所做區域各種水樣的稀釋比，根據待檢水樣的環境因素和水樣性質確定合適的稀釋比。采樣人員盡量將樣品性質、受污染程度在采樣記錄上描述清楚，以供分析人員選擇合適的分析方法。對于不確定稀釋范圍的水樣，可以進行多種梯度稀釋。

3.2.2 結果判讀
在使用多管發酵法測試時，如果在初發酵試驗中未發現產氣，可以適當地延長培養時間到48ｈ。

在使用酶底物法測試時，在培養24ｈ后結果為可疑陽性或者無顏色反應，可 適 當 延 長 培 養 時 間 到28ｈ進行結果判讀，超過28ｈ之后出現的 顏 色 反 應 不 作 為陽性結果。如果樣品有背景顏色，需做一個空白試驗，與標準盤作比較。如果加入培養基，樣品顏色過深，可能是余氯過多或者pH值過低的原因，這種方法就不適用了。

４ 質量控制
4.1 空白和平行性

以前使用的多管發酵法、濾膜法等對空白和平行性沒有明確的要求。大部分實 驗室也于對每批樣進行空白測定。

無論用哪種方法檢測，建議每個月要對實驗室用水做質量檢測，每批樣品要用無菌水做全程序空白和實驗室空白測定，確保檢測結果的準確性和可靠性。使用酶底物法分析時，對20個樣品或每批次樣品測定一個平行雙樣。
4.2 質控措施
糞大腸菌群項目的監測起步比較早，但是之前一直作為非標項目，糞大腸菌群的質控標準菌株也是在近兩年才興起。大部分實驗室分析人員之前沒有接觸過 質控，也沒有接受過這方面知識的培訓，在近兩年密碼樣考核和實驗室間比對中，該項目的效果不是很好。

目前國內使用的有證標準菌株幾乎都是從國外購買的，價格貴、購買渠道復雜且不易保存。國內實驗室很少有達到對每批樣品 使 用 有 證 標 準 菌 株 進 行 陽 性、陰性對照試驗。微生物的質控、盲樣制作難度較大，影響了國內實驗室關于微生物方面質量控制的開展。盡管如此，各個實驗室也應該盡量做到，定期使用有證標準樣品進行質量控制，使用有證標準菌株進行陰陽性對照試驗。酶底物法要求，每年至少必須進行６次定量試驗、４次定性試驗