膠原酶I型使用方法

膠原酶（Collagenase）是一種肽鏈內切蛋白酶，能特異性的識別Pro-X-Gly-Pro序列（該序列較多出現在膠原中）并切割該序列中性氨基酸（X）和甘氨酸（Gly）之間的肽鍵。許多蛋白酶都能水解單鏈且變性的膠原多肽，但膠原酶是唯-一可以降解廣泛存在結締組織內的具有三股超螺旋結構的天然膠原纖維的蛋白酶

本品來源于溶組織梭菌，是一種酶粗提物，能夠降解天然膠原和網狀纖維。還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等，分別能夠有效水解結締組織和上皮組織細胞外基質內的其他蛋白，多糖和脂質，非常適用于組織消化

膠原酶常根據活性的差異，分為四種類型：膠原酶I型、II型、III型和IV型，在應用范圍上有所不同。1）膠原酶I型（Type I Collagenase）：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶，酪蛋白酶，梭菌蛋白酶，胰蛋白酶活性）。通常用作上皮細胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細胞的制備；2）膠原酶II型（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細胞的制備；3）膠原酶III型（Type III Collagenase）：含有較低的蛋白酶活性，常用于乳腺細胞的制備；4）膠原酶IV型（Type IV Collagenase）：含有低胰酶活性，通常用于胰島細胞的制備，或者需要維持受體完整性的細胞制備實驗。

膠原酶I型的激活劑是Ca2+，適合濃度為5 mM。抑制劑是EGTA、還原性谷胱甘肽、β-巰基乙醇、巰基乙酸鈉、8-羥基喹啉、2,2'-聯吡啶等。

本品膠原酶I型的活性為：285 u/mg。

1. 膠原酶儲存液的配制

向每管100mg的膠原酶中加入100µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS（Hank’s平衡鹽溶液，含Ca2+、Mg2+），輕輕旋渦震蕩使其充分溶解，制備成1g/ml（即1000×）的儲存液。然后用低蛋白結合性的0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝成小份量，然后于-20℃避光凍存。

使用前于冰上解凍，避免反復凍融。其用于組織和細胞分散的常用濃度為：0.5-2.5mg/ml，用于軟骨消化的常用濃度為1-2mg/ml，需要根據特定的實驗條件或者參考相應的文獻資料確定所需的佳工作濃度。

2．組織的分離

1）使用無菌手術刀或剪刀將組織切成3-4mm大小的組織塊；

2）利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數次；

3）加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS，使其浸沒組織塊，并加入膠原酶至需要工作濃度；

4）于37℃孵育4-18h。消化時使用水平搖床以及用3mM的CaCl2補充消化可以提高消化效率。

5） 已分散開的細胞可使用不銹鋼或尼龍網篩篩得，收集備用。未*解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續孵育；

6）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數次；

7）細胞培養液重懸上述細胞，利用自動細胞計數器或其他方法計算活細胞密度；

8）于細胞培養皿上利用合適細胞培養基接種細胞。