酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enayme liked immunosorbent,ELISA)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù),因其具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的測(cè)定,為輔助診斷與生物科研起到了積極的作用。但在ELISA的測(cè)定過(guò)程中,影響其測(cè)定結(jié)果的因素較多,操作過(guò)程每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響,導(dǎo)致錯(cuò)誤的測(cè)定結(jié)果。

1試劑的準(zhǔn)備

　　目前各種ELISA試驗(yàn)均有商品化的試劑盒。應(yīng)選擇質(zhì)量?jī)?yōu)良、有批準(zhǔn)文號(hào)且在有效期內(nèi)的檢測(cè)試劑，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)際操作。從冰箱中取出的試劑應(yīng)放在室溫下或37℃平衡30min再進(jìn)行測(cè)試。保存試劑盒的冰箱應(yīng)經(jīng)常檢查儲(chǔ)存溫度并做好記錄，冰箱應(yīng)避免頻繁開(kāi)關(guān)。試劑使用前應(yīng)搖勻。

　　2標(biāo)本的采集和保存

　　ELISA試驗(yàn)所用標(biāo)本主要為血清，也可以用經(jīng)過(guò)預(yù)處理的唾液、尿液、糞便等生物材料。患者標(biāo)本可能含有干擾試驗(yàn)的免疫物質(zhì)，導(dǎo)致假陽(yáng)性或者假陰性的結(jié)果，干擾因素一般可分為兩類(lèi)，即內(nèi)源性和外源性干擾因素。內(nèi)源性干擾因素包括類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異性免疫球蛋白等，避免內(nèi)源性干擾因素主要通過(guò)選擇合理的試劑。外源性干擾因素包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)及標(biāo)本凝固等。在血液采集和運(yùn)輸過(guò)程時(shí)，應(yīng)注意避免溶血[1]。否則，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出血紅蛋白，血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標(biāo)記的ELISA試驗(yàn)測(cè)定中，可能會(huì)增加非特異性顯色而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。血清標(biāo)本適宜在新鮮時(shí)檢測(cè)，若推遲檢測(cè)需將標(biāo)本低溫保存。一般說(shuō)來(lái)，在7天內(nèi)檢測(cè)的血清標(biāo)本，可放置于2℃~8℃保存，超過(guò)1周檢測(cè)的需低溫冰存。因反復(fù)冰融會(huì)使抗體效價(jià)降低，所以，對(duì)需要保存做多次抗體測(cè)定的血清標(biāo)本，應(yīng)少量分裝并冰存。血清標(biāo)本應(yīng)充分離心，否則可因殘留的纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽(yáng)性結(jié)果。

　　3加樣在ELISA試驗(yàn)

　　操作中，依次有3次加樣，即加標(biāo)本、加酶結(jié)合物、加底物。加標(biāo)本一般采用手工加樣或者加樣器。手工加樣每次必須更換吸嘴，以避免交叉感染。要掌握好并在實(shí)際操作中揣摩使用技巧，避免吸樣量過(guò)多或過(guò)少。加樣器在長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)會(huì)因機(jī)械磨損或推動(dòng)桿內(nèi)附著的血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)，因此必須定期對(duì)加樣器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。加酶結(jié)合物和底物一般可直接滴加。每次加樣時(shí)，應(yīng)將所加物置于ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，注意不可濺出，不能產(chǎn)生氣泡，加酶試劑后要用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板上輕輕擦拭吸干。加底物操作時(shí)應(yīng)注意各試劑盒顯色劑不能混用，添加順序不能顛倒，不能濺出孔外。標(biāo)本較多時(shí)，需要分批操作，以免加樣板過(guò)多，造成加樣后放入孵箱前等待時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(尤其是在室溫較高時(shí))。zui后，在微型振蕩器上震蕩lmin，以保證混勻。

　　4溫育

　　ELISA反應(yīng)是抗原、抗體的結(jié)合在固相表面上發(fā)生的一系列的反應(yīng)，抗原抗體結(jié)合是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，需要經(jīng)過(guò)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)，因此ELISA反應(yīng)需要一定時(shí)間的溫育。溫育也是影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵因素，尤其是對(duì)弱陽(yáng)性標(biāo)本影響zui為明顯[2]。溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好地解決因受熱不均衡所致的周?chē)着c中央孔結(jié)果的吸光度差異(即“邊緣效應(yīng)”)。溫育常采用的溫度是43℃、37℃、室溫和4℃，其中zui常用的是37℃，也是大多數(shù)抗原抗體反應(yīng)的適合溫度。為了保證各板的溫度能迅速平衡，可將反應(yīng)板放在水浴箱中，漂浮在水面上，但反應(yīng)板不應(yīng)疊放。為避免標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)而吸附于孔壁，反應(yīng)板應(yīng)加蓋或貼封紙。注意溫育的溫度和時(shí)間，應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確無(wú)誤。因?yàn)榉跤龝r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可以出現(xiàn)非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周?chē)y以清洗*，導(dǎo)致花板。

　　5洗滌

　　洗滌是ELISA不同于均相免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的一大特征，洗滌在整個(gè)ELISA反應(yīng)過(guò)程雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟卻非常關(guān)鍵。操作者應(yīng)嚴(yán)格按照要求洗滌，因?yàn)镋LISA試驗(yàn)就是依靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的酶標(biāo)記物和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌，可以清除殘留在板孔中沒(méi)有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。采用自動(dòng)洗板機(jī)洗板，洗板機(jī)設(shè)置時(shí)間、間隔、次數(shù)要保持一致，不能過(guò)多或過(guò)少。洗板次數(shù)較少，造成殘留，引起假陽(yáng)性結(jié)果。洗板次數(shù)過(guò)多，可造成抗原抗體結(jié)合物洗脫，造成假陰性結(jié)果[3]。要保證洗液注滿各孔，防止在反應(yīng)孔中形成氣泡而造成洗滌不充分。洗板結(jié)束后，在干凈無(wú)塵的吸水紙上輕輕拍干。如洗液量不足可致洗板不*，洗板針堵塞，抽吸不*，洗板不暢，導(dǎo)致洗板效果差。

　　6顯色

　　顯色是ELISA試驗(yàn)中zui后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。適當(dāng)提高溫度，有助于加速顯色。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。在定量檢測(cè)中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。ELISA顯色結(jié)果通過(guò)酶標(biāo)儀進(jìn)行，可減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高臨界值樣本的分析準(zhǔn)確度。盡量避免肉眼直接判斷結(jié)果，因?yàn)椴煌瑐€(gè)體的視覺(jué)存在差異。應(yīng)注意，加顯色劑時(shí)，要保持顯色劑不外流。加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生較多氣泡，否則可能使假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)概率增加。

　　7比色

　　比色的方法有目視法和酶標(biāo)比色法2種。目視法簡(jiǎn)單明了，但對(duì)同一標(biāo)本，操作者的不同有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果，具有一定的主觀性。比色的結(jié)果通常用光密度表達(dá)，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度表達(dá)。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)的適宜室溫在15℃~30℃之間，使用前要先預(yù)熱儀器15~30min，使測(cè)得結(jié)果更為準(zhǔn)確。比色前，應(yīng)先用潔凈的吸水紙擦拭干凈板底附著的液體，然后將板正確放在酶標(biāo)比色儀的比色架上。綜上所述，的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，操作者必須熟練掌握基本操作技能，對(duì)每個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格仔細(xì)的核查，盡量避免假陽(yáng)性和假陰性反應(yīng)的出現(xiàn)，保證檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠，為診斷和疾病防治提供可靠的理論依據(jù)。

 1.2 試劑的準(zhǔn)備

在實(shí)驗(yàn)室，對(duì)試劑的準(zhǔn)備一般 不太注意，通常的做法是在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來(lái)即用，而忽 略了這種做法有可能影響后面時(shí)間不夠的問(wèn)題，其直接的后果是對(duì)一 些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因此，在ELISA 測(cè)定中試劑的準(zhǔn) 備zui為關(guān)鍵的是，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)，在室溫下放置20~ 30 min 后，再進(jìn)行測(cè)定，使試劑盒在使用前與室溫平衡，這樣做的 目的能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度較快地達(dá)到所需的溫度，以滿足后面的測(cè) 定需求。 樣本的因素

2.1 內(nèi)源性干擾因素 包括類(lèi)風(fēng)濕因子、 補(bǔ)體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等。 2.1.1 類(lèi)風(fēng)濕因子在類(lèi)風(fēng)濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同 濃度的類(lèi)風(fēng)濕因子，其一般為IgM 型，亦有IgG 和IgA 型，具有與 變性IgG 產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn)，因?yàn)樵贓LISA 上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG 結(jié)合， 從而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。避免其發(fā)生的方法有:用F2 替代完整的IgG。 標(biāo)本用聯(lián)有熱變性IgG 的固相吸附劑處理。檢測(cè)抗原時(shí)，可用 2-巰基乙醇加入到標(biāo)本稀釋液中使RF 降解。

2.1.2 補(bǔ)體在固相酶 免疫測(cè)定中，來(lái)自哺乳動(dòng)物的固相抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ)體系 統(tǒng)的功能。一方面，固相抗體和酶標(biāo)二抗可因其吸附及結(jié)合過(guò)程中抗 體分子發(fā)生變構(gòu)，使Fc 段的補(bǔ)體C1q 結(jié)合點(diǎn)暴露出來(lái)，使C1q 成為 一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來(lái)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。另一方面，固相抗體也 會(huì)因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能力而引起假陰 性。解決的辦法是:用EDTA 稀釋標(biāo)本。56 30 min 加熱血清 使C1q 2.2外源性干擾因素 包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污 染、標(biāo)本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和標(biāo)本凝固不全等。 2.2.1 標(biāo)本的溶血血紅 蛋白中含鐵血紅素有類(lèi)過(guò)氧化物酶的活性，因此，在以辣根過(guò)氧化物 酶為標(biāo)志的ELISA 測(cè)定中，如血清樣本中血紅蛋白濃度較高，則很 容易在溫育過(guò)程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP 底物反應(yīng)顯 色。所以在采血時(shí)應(yīng)注意手法，采集的血液勿用力振蕩，嚴(yán)防標(biāo)本溶血。